Laboratório de Patologia da Aquicultura encontra evidências conclusivas de que EHP não é o único patógeno associado à presença da Síndrome das Fezes Brancas em Litopenaeus vannamei.

*Por Luis Fernando Aranguren Caro, Ph.D.;  Hung N. Mai, Ph.D.;  Roberto Cruz-Florez, Ph.D.;  Frances Laureen Agcalao;  Marcos Rod Russel R. Alenton, Ph.D. e  Arun K. Dhar, Ph.D.

 

 

 

Cefalotórax (cabeça + tórax) de camarão branco do Pacífico ( Litopenaeus vannamei ) apresentando descoloração branca do trato gastrointestinal. Os resultados deste estudo demonstraram pela primeira vez a reprodução experimental de WFS em condições de laboratório quando camarões são infectados concomitantemente com EHP e V. parahaemolyticus .

A microbiota intestinal do camarão é fundamental para a nutrição, crescimento, resistência a patógenos e manutenção do estado de equilíbrio interno ou homeostase do hospedeiro. Características alimentares do camarão, como pastejo ativo e canibalismo, tornam o hospedeiro vulnerável à invasão de patógenos. A colonização por microrganismos alternativos desestabiliza a microbiota intestinal, o que leva a infecções e coinfecções em um trato gastrointestinal (GI) taxonomicamente diverso.

Embora haja informações limitadas sobre os mecanismos imunológicos específicos fornecidos pela microbiota intestinal do camarão, há evidências de sua interação com as atividades digestivas que afetam diretamente o crescimento do camarão e a gravidade das doenças. Da mesma forma, novas doenças emergentes foram encontradas para atingir o hepatopâncreas do camarão [glândula digestiva] e causando inibição do crescimento, disparidade de tamanho, perda de apetite e mortalidade crônica. Doenças de camarão recentemente identificadas que exibem esses sinais clínicos são a microsporidiose hepatopancreática (HPM) causada por Enterocytozoon hepatopenaei (EHP) e a Síndrome das Fezes Brancas (WFS), cujo agente ou agentes causadores permanecem não identificados.

HPM é uma doença do hepatopâncreas em camarões peneídeos causada por várias espécies de microsporídios [parasitas unicelulares formadores de esporos], incluindo EHP. Esta espécie microsporidiana foi encontrada em vários países asiáticos, como China, Vietnã, Malásia, Indonésia, Tailândia e Índia. Recentemente, EHP foi relatado no Hemisfério Ocidental na América do Sul. O principal sinal clínico de EHP no nível da fazenda é o retardo no crescimento do camarão, levando a um aumento da variabilidade de tamanho e da taxa de conversão alimentar (FCR). Em estágios avançados da doença, os camarões infectados com EHP normalmente apresentam conchas moles e mortalidade crônica. EHP foi relatado em várias espécies de camarões peneídeos de viveiro, incluindo camarão tigre preto P. monodon , L. vannamei e P. styirostris. EHP é um parasita intracelular que prolifera dentro do citoplasma das células epiteliais do túbulo afetado no hepatopâncreas.

No nível da fazenda, a WFS se manifesta como cordões fecais brancos flutuando ao longo da água de superfície em lagoas de engorda. Os camarões nessas lagoas apresentam sinais clínicos incomuns, como baixa taxa de crescimento, disparidade de tamanho, trato gastrointestinal com descoloração amarelada a esbranquiçada, casca mole e mortalidade crônica. Embora uma associação entre EHP e WFS tenha sido sugerida há muito tempo, nenhum estudo reproduziu com sucesso essa síndrome em um ambiente laboratorial controlado. Mesmo quando ocorrem infecções graves por EHP, a WFS nem sempre se manifesta, e essas observações sugerem que a WFS é o resultado de uma interação de mais de um microrganismo e outro(s) agente(s) causador(es) ainda não foram identificados. Uma forte associação entre WFS e EHP foi relatada em regiões endêmicas de EHP no Sudeste Asiático e na Venezuela. Nesses casos,Vibrio spp., que causa Necrose Hepatopancreática Séptica (SHPN).

Este artigo – adaptado e resumido da publicação original (Aranguren, LF et al. 2021. Reprodução experimental da síndrome de fezes brancas em camarão de perna branca, Penaeus vannamei . PLoS ONE 16(12): e0261289) – relata nosso estudo para isolar e identificar uma cepa de Vibrio parahaemolyticus como o elo perdido entre EHP e WFS. Co-infectando camarões infectados com EHP por um desafio de imersão com uma cepa única de V. parahaemolyticus que foi isolada do intestino de um camarão ( L. vannamei) exibindo WFS nos permitiu fornecer a primeira evidência experimental da reprodução de WFS. Até onde sabemos, esta é a primeira demonstração da reprodução de WFS sob condições controladas de laboratório usando dois patógenos únicos.

Configuração do estudo

L. vannamei livre de patógenos específicos (SPF) foram obtidos do Oceanic Institute (Oahu, Havaí). Por pelo menos dois anos consecutivos, essa população apresentou resultado negativo por PCR para todos os patógenos listados na OIE, bem como patógenos não listados na OIE, incluindo EHP. O bioensaio foi realizado no Laboratório de Patologia da Aquicultura da Universidade do Arizona. Todos os procedimentos de amostragem e eutanásia dos camarões foram realizados seguindo as diretrizes estabelecidas pela American Veterinary Medical Association.

Para informações detalhadas sobre o desenho experimental e criação de animais; isolamento de Vibrio parahaemolyticus de camarão L. vannamei apresentando WFS e preparação de inóculo; desafio experimental para reproduzir WFS; histopatologia e hibridização in situ; PCR e PCR quantitativa para detecção de V. parahaemolyticus e quantificação de EHP; e análises estatísticas, consulte a publicação original.

Resultados e discussão

Os resultados do nosso estudo descrevem pela primeira vez a reprodução experimental de WFS em camarão, L. vannamei pré-infectado com EHP (patógeno primário) e desafiado com um particular V. parahaemolyticus (patógeno secundário) isolado do trato GI de um camarão apresentando WFS. Nossos dados fornecem suporte empírico de uma forte associação de EHP com WFS, conforme registrado em diferentes regiões do mundo. Na Indonésia, de 2016 a 2018, e na Venezuela em 2019, observamos camarões com sinais clínicos de WFS apresentando lesões histológicas típicas de EHP e SHPN. Nossos achados histológicos revelaram um cenário semelhante, pois os camarões que experimentaram manifestações clínicas de WFS em condições desafiadas em laboratório também apresentaram lesões histológicas que lembram a patologia EHP e SHPN.

Fig. 1: Isolamento de Vibrio parahaemolyticus do trato GI de Litopenaeus vannamei exibindo WFS. Um camarão L. vannamei juvenil exibindo o trato gastrointestinal (GI) branco, uma manifestação clínica da WFS. Uma seção do trato GI foi plaqueada em uma placa TCBS (a). CFU Sacarose negativa indicando crescimento de Vibrio parahaemolyticus em placa TCBS (b). Crescimento de V. parahaemolyticus em meio TSA+2,5% NaCl (c).

A Síndrome das Fezes Brancas provou ter uma das etiologias mais elusivas de qualquer doença do camarão que foi caracterizada até o momento. Já faz mais de uma década desde que o primeiro relatório formal de camarões infectados com EHP mostrando WFS foi publicado, embora evidências anedóticas sugiram que WFS tenha sido observado em tanques de engorda de camarões antes desta publicação. Apesar da presença de WFS ao longo de uma década, a etiologia [causal] da síndrome permanece inconclusiva.

Existem também várias publicações com afirmações contraditórias em relação ao papel do EHP na WFS. Por exemplo, alguns autores relataram que a WFS não é causada por EHP, enquanto outros encontraram uma forte evidência de uma ligação clara entre EHP e WFS. Há um relatório alegando Vibrio cholerae como o agente etiológico da WFS, embora este achado não tenha sido confirmado por outros pesquisadores de qualquer outro lugar, apesar do fato de WFS ser um problema emergente em todo o mundo.

Vários outros estudos com o objetivo de investigar o fenômeno WFS também encontraram alguma associação entre WFS e diferentes etiologias. Cordas fecais contendo estruturas vermiformes chamadas microvilosidades transformadas agregadas (ATM) foram relatadas como um dos agentes causadores de WFS na Tailândia . A WFS parece estar correlacionada com a coinfecção com EHP e outros Vibrio spp oportunistas. que causam SHPN . Na Índia, a síndrome da mortalidade por corrida (RMS) foi relatada em camarões apresentando WFS e SHPN. Pesquisadores que estudam o microbioma em camarões afetados pela WFS relataram um aumento bacteriano significativo em Candidatus Bacilloplasma e Phascolarctobacterium e diminuição em Paracoccus eLactococcus pode contribuir para WFS em camarão . Infestação pesada de gregarina [parasitas intestinais], vibriose e enterite hemocítica, algum táxon bacteriano específico ou “patobioma” [grupos de espécies associadas a um hospedeiro que, quando presentes, reduzem a força do hospedeiro em condições ambientais adequadas] e diferentes condições ambientais em um crescimento -out pond foram propostos como os fatores que contribuem para causar WFS.

Embora os estudos para reproduzir a WFS em ambiente laboratorial tenham sido tentados por vários autores, poucos foram bem sucedidos em reproduzir consistentemente essa síndrome e determinar a etiologia. Huang et ai. descobriram recentemente que o transplante da microbiota intestinal de camarões que apresentam WFS para camarões saudáveis ??leva a manifestações clínicas semelhantes às da WFS. Eles propuseram que a WFS é causada por disbiose [desequilíbrio microbiano] na microbiota intestinal e essa doença complexa pode ser causada por patógenos específicos. Embora uma etiologia não infecciosa valha a pena ser investigada, não podemos desconsiderar o fato de que a WFS tem sido consistentemente associada a patógenos específicos, notadamente EHP. Além disso, a co-ocorrência constante de certos padrões das comunidades bacterianasem camarões que apresentam WFS nos levam a hipotetizar que WFS é resultado dos efeitos sinérgicos de dois patógenos com EHP possivelmente atuando como patógeno primário e uma bactéria não caracterizada pertencente à família Vibrionaceae atuando como patógeno secundário.

Em experimentos de desafio de laboratório, pudemos confirmar a presença de cordões fecais brancos apenas em camarões que foram pré-infectados com EHP e posteriormente expostos ao isolado de V. parahaemolyticus . Isso demonstra que, a fim de induzir manifestações clínicas de WFS, tanto EHP quanto este isolado de V. parahaemolyticus são necessários. Camarões expostos apenas a EHP ou V. parahaemolyticus não desenvolveram WFS. Portanto, a manifestação da WFS envolve uma combinação única de dois patógenos que não haviam sido observados anteriormente para nenhuma doença infecciosa de camarão conhecida até o momento.

Tabela 2. Um resumo dos dados histopatológicos e PCR de Penaeus vannamei pré-infectados com EHP e desafiados com Vibrio sp. NT: não testado.

Fig. 2: Reprodução bem sucedida de WFS em Litopenaeus vannamei sob condição experimental de laboratório. Camarão apresentando sinais clínicos da Síndrome das Fezes Brancas (WFS) em camarões que foram pré-infectados com EHP e desafiados com Vibrio parahaemolyticus por via de imersão. Cordas fecais de coloração branca a amarelada são observadas em animais em diferentes tratamentos. A seta preta indica cordão fecal branco aderido à abertura anal em camarões infectados com EHP que foram desafiados com V. parahaemolyticus . Adaptado do original.

Normalmente, em um tanque de engorda de camarão, a população cultivada começa a mostrar a presença de EHP primeiro. Mais tarde, durante o ciclo de crescimento, os camarões começam a desenvolver uma descoloração branca do trato GI, e as cordas fecais brancas flutuantes começam a aparecer na lagoa. Pela histologia de H&E [uma das principais colorações para estudar tecidos], observamos uma ordem sequencial semelhante na patologia celular durante o processo de infecção. Um patógeno primário, neste caso EHP, causou as lesões histológicas típicas e mais tarde os camarões afetados exibem SHPN causada por V. parahaemolyticus oportunista que foi usado para desafiar o camarão infectado com EHP. A imagem de histopatologia na Fig. 3D mostra claramente a co-infecção de EHP como representada por uma típica inclusão de plasmódio e bactérias no mesmo túbulo HP. Isso estabelece o papel de um patógeno primário como EHP para acentuar o impacto de bactérias oportunistas como Vibrio sp. WFS resultante.

Fig. 3: Análise histopatológica do tecido hepatopâncreas. Coloração H&E (Hematoxilina Mayer-Bennet e eosina-floxina) do tecido hepatopâncreas de Litopenaeus vannamei de quatro grupos experimentais: controle negativo SPF (A), SPF+ V. parahaemolyticus (B), controle positivo EHP (C) e EHP+ V. parahaemolyticus (D). Presença de corpos de inclusão citoplasmáticos (setas pretas) que correspondem a um estágio de plasmódio e esporos (ponta de seta) típicos de infecção por EHP são mostrados. As barras de escala de 200 μm (A), 50 μm (B) e 10 μm (CD) são indicadas. Adaptado do original.

Os camarões do grupo de tratamento EHP+ V. parahaemolyticus em ambos os nossos ensaios apresentaram uma disparidade de tamanho alta, que é maior ou comparável aos camarões infectados com EHP ou V. parahaemolyticus sozinhos (Tabela 1). Um achado semelhante também foi relatado por Liu et al. (2015. Desenvolvimento de ensaio de PCR em tempo real para detecção do microsporídio Enterocytozoon hepatopenaei e detecção em amostras de camarão sob diferentes. Prog Fish Sci. 2015.). Esses autores relataram o impacto do EHP na variação de tamanho de camarões em uma fazenda de engorda quando a carga de patógenos foi >10 3 cópias/ng de DNA total no tecido hepatopancreático. Em nosso estudo, a carga média de EHP em camarões com sinais clínicos de WFS foi de 1,4 × 10 7cópias/ng de DNA extraído, que é maior do que Liu et al. (2015) mencionado é necessário observar alta variação de tamanho. Em estudos anteriores, camarões exibindo WFS mostram um número de cópias na ordem de ~ 10 6 cópias/ng de DNA de hepatopâncreas extraído .

A reprodução de WFS em camarões infectados com EHP e desafiados com V. parahaemolyticus é muito provavelmente devido às ações sinérgicas do microsporídio e de uma cepa bacteriana particular nos túbulos hepatopancreáticos. Como mencionado anteriormente, Huang e colegas sugeriram que a WFS é causada pela disbiose da microbiota intestinal e essa proposição tem algumas semelhanças com nossa descoberta. Nossas observações durante o estágio inicial da infecção por EHP em camarões que apresentam WFS incluem alto teor de lipídios no túbulo hepatopancreático, mas algumas células do hepatopâncreas estão fortemente infectadas. No entanto, neste ponto, não há resposta imune celular óbvia do camarão, como inflamação ou congestão hemocítica. Mais tarde, à medida que a infecção progride, as células epiteliais infectadas com EHP no túbulo HP descamam e expõem a membrana basal subjacente do túbulo a bactérias oportunistas que colonizam rapidamente os túbulos afetados.

A colonização bacteriana então leva a uma resposta celular do hospedeiro resultando em inflamação hemocítica, subsequente melanização [pigmentação] e descamação adicional. Há uma atrofia moderada a grave das células do túbulo hepatopâncreas levando a uma disfunção parcial ou total do hepatopâncreas. Em um camarão saudável, a maior parte das fezes geradas durante a digestão da ração consiste em vacúolos residuais das células do hepatopâncreas, que envolvem um importante processo de embalagem e remoção de resíduos do sistema digestivo. Em camarões infectados com EHP, quando o aglomerado de células do hepatopâncreas é liberado do túbulo para o trato GI, a combinação de lipídios, ração digerida/não digerida, EHP e a massa bacteriana contribuirão para a formação de um cordão fecal esbranquiçado. É possível, devido à presença de lipídios nas fezes,

Alterações envolvendo o trato gastrointestinal, onde um sinal da doença são as fezes esbranquiçadas, são comuns a todos os animais, incluindo humanos. Em humanos, as fezes esbranquiçadas são causadas por alterações no microbioma intestinal ou por patógenos específicos, como Cryptosporidium spp. Este também pode ser o caso da WFS de camarão, onde a doença – e, portanto, os sinais particulares – são causados ??por duas etiologias distintas. Nosso estudo mostra claramente que os dois patógenos induzem fezes brancas em camarões e mostra decisivamente que a EHP desempenha um papel central no desenvolvimento dessa síndrome, como nosso grupo de pesquisa propôs em pesquisas anteriores .

Nosso estudo fornece evidências conclusivas de que o EHP não é o único patógeno associado à presença da Síndrome das Fezes Brancas. Na Tailândia, alguns estudos mostraram a associação de WFS na população de camarões com um aumento de Vibrio spp. onde foram analisados ??os intestinos de camarões, com e sem WFS. Um aumento da população de Vibrio intestinal de um camarão normal com 1,8×10 7 UFC [unidades formadoras de colônias]/g população versus camarão WFS com 6,1×10 7 UFC/g. Alguns destes Vibrio . spp encontrados nessas amostras foram V. parahaemolyticus , V. vulnificus e V. damsela . Isso corrobora nossa identificação de uma cepa de V. parahaemolyticus como o patógeno não identificado que co-infecta com EHP em camarão manifestando WFS. No entanto, é possível que outras espécies de Vibrio além de V. parahaemolyticus possam induzir WFS.

Conclusões

EHP é um patógeno entérico primário de camarões peneídeos. A infecção com EHP em associação com uma cepa particular de V. parahaemolyticus leva ao desenvolvimento de WFS. Esses achados também corroboram e explicam por que a WFS se manifesta em áreas onde EHP e V. parahaemolyticus também são endêmicos.

*Adaptação de artigo feita para o site da Global Seafood Alliance (GSA), instituição que promove práticas responsáveis ??de frutos do mar em todo o mundo por meio de educação, defesa e demonstração. A GSA convoca líderes da indústria de frutos do mar, academia e ONGs para colaborar em questões transversais como responsabilidade ambiental e social, saúde e bem-estar animal, segurança alimentar e muito mais. A GSA é uma organização orientada por membros. Os membros incluem produtores certificados, empresas e indivíduos.